一、COVID-19多器官单细胞与空间转录组图谱的构建新型冠状病毒肺炎Corona Virus Disease 2019, COVID-19由SARS-CoV-2病毒感染引起临床表现多样可从无症状感染发展至重症肺炎乃至死亡。目前认为急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征以及多器官衰竭等直接并发症是导致COVID-19患者死亡的主要原因。然而迄今为止关于COVID-19患者各器官在分子与细胞水平的病理改变仍缺乏深入了解。Nature杂志在线发表的一项重要研究题为“COVID-19 tissue atlases reveal SARS-CoV-2 pathology and cellular targets”。该研究整合应用单细胞测序与数字空间谱DSP空间转录组技术系统绘制了COVID-19患者肺、肝、肠等多个器官组织的单细胞图谱及空间图谱并深入解析了相关基因表达特征为揭示SARS-CoV-2的病理机制及细胞靶点提供了重要依据。二、研究总体思路与技术路线图1研究思路图2实验及分析流程三、主要研究结果01 COVID-19患者肺部的单细胞图谱通过自动细胞类型注释工具研究者在COVID-19患者肺部组织的单细胞核图谱中识别出28种细胞类群包括实质细胞、内皮细胞及免疫细胞等。与正常肺部组织相比COVID-19患者肺部的II型肺泡细胞AT2数量显著减少而树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、成纤维细胞及内皮细胞的数量均有所增加。在COVID-19患者的II型肺泡细胞中多个与宿主病原体反应相关的基因表达上调而编码肺表面活性物质、具有抑制肺纤维化功能的基因则表达下调。在COVID-19患者的肺细胞中PATSPre-alveolar type 1 transitional cell state基因表达更为显著。部分PATS细胞同时表达KRT8/CLDN4/CDKN1A及KRT5/TP63/KRT17基因提示这些细胞可能为TP63阳性肺内基底样组细胞Intrapulmonary basal-like progenitor cells, IPBLP在肺泡严重受损时作为储备细胞发挥作用。基于上述发现研究者提出了肺泡上皮细胞再生的模型1在健康肺泡中II型肺泡细胞可通过自我更新维持自身群体并经由转分化过程转化为I型肺泡细胞2在COVID-19患者的肺泡中II型肺泡细胞的自我更新及其向I型肺泡细胞的转分化均受到抑制导致PATS细胞累积同时远端气道中的IPBLP细胞开始向肺泡区域迁移。图3COVID-19 患者肺部单细胞核图谱02 肺细胞中SARS-CoV-2病毒RNA的富集分析与既往研究一致本研究发现新冠病毒载量Viral load与患者从症状出现至死亡的时间呈负相关。在肺部不同细胞类型中髓系细胞Myeloid cells特别是CD14high CD16high炎性单核细胞及LDB2high OSMRhigh YAP1high巨噬细胞含有更高水平的SARS-CoV-2病毒RNA。值得注意的是这些表达病毒RNA的细胞并不同时表达ACE2、TMPRSS2等病毒进入相关因子。图4吞噬细胞和内皮细胞富集 SARS-CoV-2 病毒的RNA03 COVID-19患者肺部的空间转录组图谱研究者采用数字空间分析Digital Spatial Profiling, DSP技术构建了尸检样本肺部组织的空间转录组学图谱。结果显示在上皮细胞PanCK区域中I型与II型肺泡细胞占据主导地位。在非上皮细胞PanCK-区域中COVID-19患者较非COVID-19对照表现出更多的成纤维细胞及肌成纤维细胞。比较COVID-19患者与非COVID-19对照肺部相应感兴趣区域AOIs发现COVID-19患者肺组织中干扰素-α与干扰素-γ响应基因及氧化磷酸化相关基因表达显著升高而TNFα、IL2-STAT5及TGF信号通路、顶端连接及缺氧通路相关基因表达则显著下降。在同一尸检样本中比较发炎与未发炎的AOIs区域结果显示发炎区域中先天免疫及炎症相关基因表达显著增加而Claudins及紧密连接通路相关基因表达下降。进一步比较COVID-19患者肺部病毒含量高与低的AOIs区域发现病毒基因ORF1ab及S基因被诱导表达趋化因子基因CXCL2与CXCL3表达显著上升。值得关注的是NT5C基因在病毒含量高的AOIs区域中亦显著上调目前该基因在肺损伤中的具体作用尚不明确有待进一步研究。图5COVID-19 患者肺和正常肺COVID-19 患者肺感染区和非感染区细胞组成和基因表达比较04 COVID-19对心脏、肾脏及肝脏细胞组成的影响在COVID-19尸检样本的肝脏、心脏及肾脏单细胞核图谱中检测到少量SARS-CoV-2病毒RNA这可能与单细胞核RNA检测方法有关后续可通过DSP及RNAscope等技术进行验证。比较COVID-19患者与正常对照心脏组织的单细胞核图谱发现COVID-19患者心肌细胞及周细胞比例显著降低而血管内皮细胞比例显著增加。心肌细胞、周细胞及成纤维细胞中上调的基因包括PLCG2与AFDN。在这些细胞类型中上调的通路涉及氧化应激诱导的细胞凋亡、细胞黏附与免疫通路及细胞分化通路。图6COVID-19 患者心脏、肝脏肾脏单细胞核图谱四、结论综上所述本研究综合应用单细胞测序技术与数字空间分析DSP空间转录组测序技术系统构建了COVID-19患者肺、肾、肝及心脏组织的单细胞核图谱以及肺部的空间转录组图谱。在此基础上研究进一步结合COVID-19全基因组关联分析GWAS数据识别出与新冠肺炎遗传风险相关的具体细胞类型。上述单细胞及空间图谱为深入理解SARS-CoV-2导致人体器官衰竭乃至最终死亡的病理机制提供了重要的数据基础和理论依据。