兔抗ATR抗体亲和纯化，支持轻链专用二抗消除背景干扰

本文系统介绍由艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人ATR蛋白的兔源多克隆抗体货号A300-137A的核心技术参数、标准化操作流程及功能应用要点适用于DNA损伤应答、复制胁迫响应及细胞周期检查点调控等研究领域。一、产品基本特性该抗体为兔多克隆抗体以全IgG形式提供未经标记修饰。其特异性靶点为ATR共济失调毛细血管扩张症与Rad3相关蛋白又称丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATR仅识别人源样本适用于人类细胞系或组织裂解物的检测。抗体经抗原亲和纯化处理通过固相载体上固定的ATR特异性表位进行吸附洗脱有效去除血清中的非特异性IgG确保高纯度与低背景。免疫原对应人ATR蛋白第400至450位氨基酸区域参考序列NP_001175.1基因ID 545。该表位位于蛋白N端附近避免了与ATM、DNA-PKcs等其他PI3K家族激酶的交叉识别。抗体浓度标定为1000 µg/ml采用比尔定律测定1 mg/ml IgG在280 nm处吸光度为1.4。总蛋白量未标注可根据实际需要按量取用。二、储存与缓冲体系储存条件2 – 8°C冷藏严禁冷冻。反复冻融会破坏抗体天然构象导致效价下降或形成聚集体。有效期收货之日起1年。未开封且严格避光、避免温度波动的情况下可维持完整活性。缓冲液组成Tris-枸橼酸/磷酸缓冲液pH 7–8含0.09%叠氮钠作为抗菌防腐剂。关键注意事项叠氮钠会共价修饰HRP的酪氨酸残基不可逆抑制酶活性。若后续使用HRP标记二抗进行化学发光检测必须通过充分洗涤至少5次每次5分钟去除叠氮钠或选用不含叠氮钠的配方如含0.02%硫柳汞的PBS。对于直接偶联HRP的一抗本产品不适用。三、推荐应用与操作流程1. 免疫沉淀 (IP)抗体用量6 µg抗体 / mg总蛋白裂解物。通常一个10 cm培养皿的贴壁细胞80–90%融合度总蛋白量约1–2 mg需添加12 µg抗体。裂解液选择推荐使用非变性IP裂解缓冲液如50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40 或 0.3% CHAPS。由于ATR是核内蛋白且与染色质紧密结合建议裂解前用低盐缓冲液预洗细胞裂解后辅以Benzonase核酸酶25 U/ml或超声处理功率30%5秒脉冲/5秒间隔共1分钟以释放染色质结合的ATR。操作步骤抗体与澄清裂解液于4°C旋转孵育2小时至过夜过夜有利于低丰度蛋白富集。随后加入Protein A/G磁珠或琼脂糖珠继续孵育1–2小时。磁珠用裂解缓冲液洗涤3–5次后加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸变性。2. 蛋白质印迹 (WB)工作稀释度1:2000 – 1:10,000。初次实验建议从1:2000开始若信号过强或背景升高可逐步稀释至1:5000或1:10000。凝胶体系3–8% Tris-醋酸凝胶必需。ATR分子量极大约300 kDa常规Tris-甘氨酸凝胶无法有效分离高分子量蛋白易导致条带拖尾或完全无法转入膜。Tris-醋酸体系配合低浓度丙烯酰胺可提供更好的大分子分辨率。封闭与稀释液含5%脱脂奶粉的TBSTTris-缓冲盐 0.1% Tween-20。避免使用BSA因其可能引入非特异性背景。一抗孵育4°C过夜12–16小时。短时室温孵育不足以检测低丰度核蛋白。二抗选择细胞裂解物直接WB使用山羊抗兔IgGHLHRP二抗如A120-101P按说明书推荐稀释度通常1:5000–1:20000。IP后WB检测免疫沉淀洗脱物中包含兔IgG重链约55 kDa和轻链约25 kDa。由于ATR分子量为300 kDa远高于重链和轻链常规抗兔全IgG二抗不会产生干扰。但若同时检测ATR的磷酸化修饰或低分子量的共沉淀蛋白建议使用抗兔IgG轻链特异性HRP二抗并在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清货号S100-020以封闭非特异性Fc受体。转膜条件建议使用0.45 µm PVDF膜硝酸纤维素膜易脆且对大分子结合效率低。湿转法100 V2.5小时冰浴或 30 V4°C过夜。甲醇浓度控制在5–10%之间过高会导致大蛋白沉淀。分子量预期全长ATR约300 kDa可能出现降解条带~250 kDa、150 kDa属常见现象尤其在蛋白酶抑制不足或反复冻融样本中。四、靶点功能与生物学背景ATR是磷脂酰肌醇3激酶相关激酶家族PIKK的核心成员与ATM、DNA-PKcs同源。不同于ATM主要响应DNA双链断裂ATR更专一地感知DNA复制胁迫和紫外线损伤。当复制叉停滞或单链DNA暴露时ATR通过其相互作用蛋白ATRIPATR相互作用蛋白结合RPA包被的单链DNA进而被激活。ATR激酶通过磷酸化下游底物启动检查点信号通路介导细胞周期阻滞S期和G2/M期、复制叉稳定、DNA修复或凋亡。已知底物包括BRCA1调控同源重组p53诱导细胞周期阻滞或凋亡Chk1关键效应激酶触发S期和G2/M期检查点Rad17加载PCNA样复合物至损伤位点E2F1调控转录ATR基因突变可导致塞克尔综合征Seckel syndrome表现为小头畸形和侏儒症以及更广泛的DNA损伤应答缺陷。ATR抑制剂已在肿瘤治疗中进入临床试验用于联合PARP抑制剂或化疗药物协同杀伤复制应激高的癌细胞。五、别名与同源性该抗体识别人ATR蛋白的400–450残基该区域在哺乳动物中具有较高的保守性但反应性仅验证为人不推荐用于小鼠、大鼠或其他物种除非经序列比对验证100%一致。常见别称共济失调毛细血管扩张症与Rad3相关蛋白FRAP相关蛋白1FRP1MEC1同源物SCKL1塞克尔综合征1型