一、产品概述由艾美捷Bethyl Laboratories推出的ASH2抗体货号A300-489A是一款针对人ASH2LASH2 like histone lysine methyltransferase complex subunit的兔源多克隆抗体由美国制造采用抗原亲和纯化工艺制备。该抗体以未偶联的完整IgG形式提供浓度为1000 µg/ml适用于染色质免疫沉淀ChIP、免疫组织化学IHC、免疫沉淀IP和免疫印迹WB等多种应用场景是表观遗传学研究中检测组蛋白甲基转移酶复合物亚基的重要工具。二、技术规格参数 | 详细信息靶标 | ASH2 / ASH2L反应性 | 人宿主 | 兔克隆性 | 多克隆格式 | 完整IgG亚型 | IgG偶联物 | 未偶联纯度 | 抗原亲和纯化抗原物种 | 人浓度 | 1000 µg/ml保存条件 | 2-8°C有效期 | 收货后1年缓冲液体系Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH 7-8含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。三、免疫原与纯化工艺该抗体识别的表位位于人ASH2蛋白第575位氨基酸至C末端第628位残基之间编号参考Swiss-Prot条目Q9UBL3GeneID 9070。表位覆盖了ASH2的C端结构域该区域在复合物组装中发挥重要作用。纯化方式使用固相载体上固定的ASH2特异性表位进行抗原亲和纯化浓度测定通过比尔定律测定1 mg/mL IgG在280 nm波长下的吸光度为1.4四、应用方法与实验条件免疫印迹WB推荐稀释比1:2000 至 1:20,000稀释范围宽泛高倍稀释仍可有效检测封闭与稀释液5% 牛奶-TBST一抗孵育过夜孵育细胞裂解物检测使用山羊抗兔IgG重轻链抗体A120-101P免疫沉淀物检测使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体封闭缓冲液中需添加5%正常猪血清货号S100-020免疫沉淀IP推荐用量6 µg抗体 / mg裂解物染色质免疫沉淀ChIP推荐用量1-5 µg该抗体过往批次已验证可用于此应用ChIP-chip10 µg过往批次已验证免疫组织化学IHC推荐稀释比1:500 至 1:2000抗原修复推荐使用柠檬酸盐缓冲液pH 6.0进行热诱导抗原修复样本类型福尔马林固定、石蜡包埋FFPE组织切片五、产品背景信息ASH2在组蛋白甲基转移酶复合物中的角色ASH2Absent, Small, or Homeotic discs 2正式基因名ASH2L是人源Set1样组蛋白甲基转移酶HMT复合物的核心亚基之一。Set1样复合物负责组蛋白H3赖氨酸4H3K4的单甲基化、二甲基化和三甲基化——这一表观遗传标记通常与转录激活相关。复合物的多样性ASH2与多种蛋白在多个Set1样复合物中发生相互作用这些复合物包含不同的MLL家族成员组合。已知的相互作用伙伴包括功能类别 | 蛋白名称甲基转移酶核心 | MLL、MLL2、MLL3、MLL4核心调控亚基 | RBBP5、WDR5辅助因子 | hDPY-30、hSwd2染色质靶向 | CXXC1转录调控 | HCF1、Menin、PTIP、PA1、NCOA6表观修饰酶 | UTXH3K27去甲基化酶六、生物学意义ASH2L作为支架蛋白在复合物的组装和催化活性中发挥关键作用。H3K4甲基化水平的失调与多种疾病相关包括癌症、发育异常和血液系统恶性肿瘤。靶向ASH2L及其复合物的研究有助于深入理解表观遗传调控机制。别名ASH2、ash2 (absent, small, or homeotic)-like、ASH2L1、ASH2L2、ASH2-like protein、Bre2、set1/Ash2 histone methyltransferase complex subunit ASH2七、使用建议与优化指南1. 应用选择与起始用量应用 | 起始用量/稀释比 | 优化方向WB | 1:10,000稀释 | 根据表达丰度在1:2,000-1:20,000之间调整IP | 6 µg/mg裂解物 | 低表达样本可升至10 µg/mgChIP | 2-3 µg /反应 | 在1-5 µg范围内优化ChIP-chip | 10 µg /反应 | 确保足够的DNA产量IHC | 1:1000稀释 | 在1:500-1:2000范围内测试务必进行抗原修复2. 免疫印迹注意事项预期分子量ASH2蛋白理论分子量约68 kDa但可能因翻译后修饰出现迁移差异60-75 kDa凝胶浓度建议使用10-12% SDS-PAGE凝胶以获得良好分辨率阳性对照HeLa、HEK293或K562细胞裂解物可作为阳性对照这些细胞中ASH2L普遍高表达高倍稀释优势该抗体推荐稀释比高达1:20,000说明亲和力高可有效节约抗体用量降低非特异性背景3. 免疫沉淀优化裂解液选择使用非变性裂解液如含150 mM NaCl的NP-40裂解液以维持蛋白复合物的天然状态预清除裂解物与Protein A/G琼脂糖珠预孵育30-60分钟减少非特异性结合抗体用量从6 µg/mg裂解物开始ASH2在多数细胞系中表达水平中等如富集效率低可增加至10 µg/mg洗涤条件使用含0.1-0.5% Triton X-100或NP-40的TBS缓冲液洗涤3-5次每次5-10分钟洗脱使用2× SDS上样缓冲液95°C加热10分钟离心后取上清进行WB检测4. 染色质免疫沉淀ChIP关键参数交联1%甲醛室温交联10分钟甘氨酸终止终浓度0.125 M染色质片段化超声处理至DNA片段大小200-600 bp。建议在琼脂糖凝胶上验证片段化效率抗体用量从2-3 µg开始ASH2作为复合物亚基ChIP富集效率通常良好对照设置阳性对照使用H3K4me3抗体ASH2复合物的催化产物阴性对照使用兔同型IgGqPCR引物设计靶向已知ASH2结合区域如HOX基因启动子或高表达基因的转录起始位点5. 免疫组织化学IHC优化指南抗原修复必须使用柠檬酸盐缓冲液pH 6.0进行热诱导修复。可选用高压锅2分钟或微波炉高火15-20分钟加热。省略此步骤可能导致信号完全丢失封闭使用5%正常山羊血清或5% BSA室温封闭1小时一抗孵育推荐4°C过夜孵育。从1:1000稀释开始根据信号强度和背景优化检测系统推荐使用HRP标记的二抗配合DAB显色或使用荧光标记二抗进行多重染色对照设置使用兔IgG同型对照替代一抗作为阴性对照使用已知阳性组织如扁桃体或睾丸验证抗体性能复染推荐使用苏木精进行细胞核复染6. 储存与稳定性存放于2-8°C严禁冷冻。反复冻融会导致抗体聚集和活性丧失抗体在叠氮化钠存在下可稳定保存1年取用时应使用无菌吸头避免微生物污染如需分装建议分装后添加等体积甘油存放于-20°C但产品说明书未明确推荐此方式优先按指示保存